4有机化合物的分离与提纯技术（第10页）
薄层的展开需在密闭的容器（层析缸）中进行。先将展开剂放在层析缸中，液层高度约0。5cm，在层析缸中衬一滤纸，使展开剂蒸气饱和5～10min。再将点好样品的薄板按图248所示放入层析缸中进行展开。注意：展开剂液面的高度应低于样品斑点。在展开过程中，样品斑点随着展开剂向上迁移，当展开剂前沿至薄层板上边约0。5cm时，立刻取出薄层板，用铅笔或小针画出溶剂前沿的位置，放平晾干后即可显色。
图248薄层层析的展开装置
5。 显色
如果化合物本身有颜色，展开后就可直接观察它的斑点。但大多数有机化合物是无色的，看不到色斑，只有通过显色才能使斑点显现。常用的显色方法有显色剂法和紫外光显色法。
① 显色剂法：在溶剂蒸发前用显色剂喷雾显色。不同类型的化合物需选用不同的显色剂，见表29。薄层色谱还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。也可用卤素斑点试验法来使薄层色谱斑点显色。许多有机化合物能与碘生成棕色或黄色的配合物。利用这一性质可将几粒碘置于密闭容器中，待容器充满碘蒸气后，将展开后的色谱板放表29一些常用显色剂的配制及使用范围
显色剂配制方法能被检出对象浓硫酸98%大多数有机化合物在加热后可显出黑色斑点碘蒸气将薄层板放入缸内被碘蒸气饱和数分钟很多有机化合物显黄棕色（烷烃和卤代烃除外）碘的氯仿溶液0。5%碘氯仿溶液很多有机化合物显黄棕色（烷烃和卤代烃除外）磷钼酸乙醇溶液5%磷钼酸乙醇溶液，喷后120℃烘，还原性物质显蓝色，氨薰，背景变为无色还原性物质显蓝色铁氰化钾三氯化铁试剂1%铁氰化钾，１%三氯化铁使用前等量混合还原性物质显蓝色，再喷2molL盐酸，蓝色加深，检酚、胺、还原性物质四氯邻苯二甲酸酐2%溶液，溶剂∶丙酮氯仿（体积比10∶1）芳烃硝酸铈铵6%硝酸铈铵的2molL硝酸薄层板在105℃烘5min，喷显色剂，多元醇在黄色底色上有棕黄色斑点香兰素硫酸3g香兰素溶于95%100mL乙醇中，再加入0。5mL浓硫酸高级醇及酮呈绿色茚三酮0。3g茚三酮溶于100mL乙醇，喷后，100℃热至斑点出现氨基酸、胺、氨基糖、蛋白质入，碘与展开后的有机化合物可逆地结合，在几秒钟到数分钟内化合物斑点的位置呈黄棕色。色谱板自容器取出后，呈现的斑点一般在几秒钟内消失，因此必须用铅笔标出化合物的位置。碘熏显色法是观察无色物质的一种简便有效的方法，因为碘可以与除烷烃和卤代烃以外的大多数有机物形成有色配合物。
三、仪器与试剂
1． 仪器
层析缸、载玻片、研钵、点样毛细管、镊子、烧杯、紫外分析仪、铅笔、直尺。
2。 试剂
硅胶GF254、0。5%羧甲基纤维素钠水溶液、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、氯仿、对硝基苯胺、邻硝基苯胺。
四、实验步骤
邻硝基苯胺和对硝基苯胺[5]的薄层色谱。
用1％羧甲基纤维素钠水溶液和吸附剂硅胶GF254制备浆料铺板，薄板干燥、活化后备用。
将邻硝基苯胺和对硝基苯胺及它们的混合物分别用无水乙醇溶解，配制成约0。1％的浓度后点样，每块薄板上点两个样点，距离约１cm。
将展开剂氯仿[6]加入层析缸中，盖上盖子，3～5min后形成饱和蒸汽状态，将薄板斜放层析缸中展开。展开剂到薄板上端约0。5cm时取出，晾干，直接观察或经紫外分析仪显色后观察斑点。测量，计算比移值Rf。【注释】
[1] 制板常用2。5cm×7。5cm的玻璃片。目前有市售已铺好的薄板供应。
[2] 薄板制备的好与坏直接影响色谱的分离效果，在制备过程中应注意以下几点：① 涂层浆料要制成均匀而又不带块状的糊状，在研钵中搅拌比在烧杯中效果更佳；② 铺板前一定要将玻璃板洗净、擦干；③ 涂布速度要快；④ 铺板时，涂层厚度（0。25～１mm）要尽量均匀，不能有气泡、颗粒等。否则，在展开时溶剂前沿不齐，色谱结果也不易重复。
[3] 不得风吹及避免尘埃洒落，应放在水平的平板上室温下自然晾干，千万不要快速干燥，否则薄层板会出现裂痕。为保证晾干充分，最好将铺好的薄板放置过夜后再活化。
[4] 把涂好的薄板置于室温自然晾干后，再放在烘箱内加热活化，进一步除去水分。活化时需慢慢升温。硅胶板一般在105～110℃的烘箱中活化0。5h即可。氧化铝板在200℃烘4h可得到活性Ⅱ级的薄层板，１50～160℃烘4h可得到活性Ⅲ～Ⅳ级的薄层板。活化后的薄板应保存在干燥器中备用。
[5] 试样也可选择间硝基苯胺、2，4二硝基苯胺。
[6] 本实验还可以用石油醚乙酸乙酯作为展开剂，V石油醚∶V乙酸乙酯=4∶1。
五、思考题
（1） 影响比移值Rf的因素有哪些?
（2） 影响薄板分离效果的因素有哪些?
（3） 展开剂的液面高出薄板的样点，将会产生什么后果?
（4） 用薄层色谱分析混合物时，如何确定各组分在薄板上的位置?如果斑点出现拖尾现象，可能的原因是什么？
一、实验目的
（1） 学习柱色谱的原理及其意义。
（2） 掌握柱色谱分离有机化合物的实验操作技术。
二、实验原理
柱色谱（n atography），又称柱层析，是通过色谱柱（层析柱）来实现分离、提纯少量有机化合物的有效方法。常用的有吸附柱色谱和分配柱色谱两类，前者常用氧化铝和硅胶作固定相，后者则以附着在惰性固体（如硅藻土、纤维素等）上的活性**作为固定相（也称固定液）。实验室中最常用的是吸附色谱，因此这里重点介绍吸附色谱。
**样品从柱顶加入，当溶液流经吸附柱时，各组分同时被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入洗脱剂洗脱，当洗脱剂流下时，由于固定相对各组分吸附能力不同，各组分以不同的速度沿柱下移，若是有色物质，则在柱上可以直接看到色带，如图249（a）所示。继续用洗脱剂洗脱时，吸附能力最弱的组分随洗脱剂首先流出，吸附能力强的后流出，分别收集各组分，再逐个鉴定。若是无色物质，可用紫外光照射，有些物质呈现荧光，可作检查，或在洗脱时，分段收集一定体积的洗脱液，然后通过薄层色谱（参见实验十二）逐个鉴定，再将相同组分的收集液合并在一起，蒸除溶剂，即得到单一的纯净物质。如此，可将各组分分离开。
色谱法能否获得满意的分离效果，关键在于色谱条件的选择及其操作的规范性，下面介绍柱色谱条件的选择及其操作规程。
1。 吸附剂的选择
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。吸附能力与颗粒大小有关，颗粒太粗，流速快分离效果不好，太细则流速慢，通常使用的吸附剂的颗粒大小以１00～150目为宜。色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝是用1％盐酸浸泡后，用蒸馏水洗至悬浮液pH为4～4。5，用于分离酸性物质；中性氧化铝pH为7。5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9～10，用于分离生物碱、胺、碳氢化合物等。市售的硅胶略带酸性。
吸附剂的活性与其含水量有关，含水量越高，活性越低，吸附剂的吸附能力越弱；反之则吸附能力越强。吸附剂的含水量和活性等级关系如表210所示。表210吸附剂的含水量和活性等级关系
活性等级ⅠⅡⅢⅣⅤ氧化铝含水量（%）０361015硅胶含水量（%）０5152538一般常用的是Ⅱ级吸附剂。Ⅰ级吸附性太强，且易吸水；Ⅴ级吸附性太弱。吸附剂按其相对的吸附能力可粗略分类如下。
① 强吸附剂：低含水量的氧化铝、硅胶、活性炭。
② 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、氧化镁。