4有机化合物的分离与提纯技术（第11页）
吸附剂的吸附能力不仅取决于吸附剂本身，还取决于被吸附物质的结构。化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，以氧化铝为例，对各种化合物的吸附性按以下次序递减：
酸和碱＞醇、胺、硫醇＞酯、醛、酮＞芳香族化合物＞卤代物＞醚＞烯＞饱和烃
2。 洗脱剂的选择
在柱色谱分离中，洗脱剂的选择是至关重要的。通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附剂活性来考虑。首先，洗脱剂的极性不能大于样品中各组分的极性。否则会由于洗脱剂在固定相上被吸附，迫使样品一直保留在流动相中。在这种情况下，组分在柱中移动的速度非常快，难以建立起分离所要达到的平衡，影响分离效果。另外，所选择的洗脱剂必须能够将样品中各组分溶解，如果被分离的样品不溶于洗脱剂，则各组分可能会牢固地吸附在固定相上，而不随流动相移动或移动很慢。
一般洗脱剂的选择是通过薄层色谱实验来确定的（具体方法见实验12薄层色谱），哪种展开剂能将样品中各组分完全分开，即可作为柱色谱的洗脱剂。当单纯一种展开剂达不到所要求的分离效果时，可考虑选用混合展开剂。
色谱柱的洗脱首先使用极性最小的溶剂，使最容易脱附的组分分离，然后逐渐增加洗脱剂的极性，使极性不同的化合物按极性由小到大的顺序自色谱柱中洗脱下来。常用洗脱剂的极性及洗脱能力按如下顺序递增：
己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜环己烷乙酸乙酯（80∶20）＜二氯甲烷乙醚（80∶20）＜二氯甲烷乙醚（60∶40）＜环己烷乙酸乙酯（20∶80）＜乙醚＜乙醚甲醇（99∶1）＜乙酸乙酯＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸
极性溶剂对于洗脱极性化合物是有效的，非极性溶剂对于洗脱非极性化合物是有效的，若分离复杂组分的混合物，通常选用混合溶剂。
所用洗脱剂必须纯粹和干燥，否则会影响吸附剂的活性和分离效果。
3。 色谱柱的大小和吸附剂的用量
柱色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱剂的选择，而且还与色谱柱的大小和吸附剂的用量有关。一般要求柱中吸附剂用量为待分离样品量的30～40倍，若需要时可增至100倍，柱高和直径之比一般为10∶1。
4。 装柱
装柱是柱色谱中最关键的操作，装柱的好坏直接影响分离效率。装柱之前，先将空柱洗净干燥，然后将柱垂直固定在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团脱脂棉或玻璃棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面铺上一层厚0。5～1cm的石英砂，然后进行装柱。装柱的方法有湿法和干法两种。
将吸附剂用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约34柱高的洗脱剂，再边敲打柱身边将调好的吸附剂倒入柱中，同时打开柱子的下端活塞，在色谱柱下面放一个干净并干燥的锥形瓶，接收洗脱剂。当装入的吸附剂有一定的高度时，洗脱剂流下速度变慢，待所用吸附剂全部装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充均匀并没有气泡。柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0。5cm厚的石英砂或覆盖一片比柱内径略小的圆形滤纸[1]。在整个装柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于吸附剂最上端，否则柱内会出现裂痕和气泡。
（２） 干法装柱
在色谱柱上端放一个干燥的漏斗，将吸附剂倒入漏斗中，使其成为细流连续地装入柱中，并轻轻敲打色谱柱柱身，使其填充均匀，再加入洗脱剂湿润。也可先加入34的洗脱剂，然后倒入干的吸附剂。由于氧化铝和硅胶的溶剂化作用易使柱内形成缝隙，所以这两种吸附剂不宜用于干法装柱。
如果装柱时吸附剂的顶面不呈水平，将会造成非水平的谱带，如图249（b）所示；若吸附剂表面不平整或内部有气泡时会造成沟流现象（谱带前沿一部分向前伸出），如图250所示。所以，吸附剂要均匀装入管内，装柱时要轻轻不断地敲击柱子，以除尽气泡，不留裂痕，防止内部造成沟流现象，影响分离效果。但不要过分敲击，否则太紧密而流速太慢。
图249水平的和非水平的谱带前沿的对比图250沟流现象5。 加样及洗脱
**样品可以直接加到色谱柱中，如浓度低可浓缩后再进行分离。固体样品应先用少量的溶剂溶解后再加到柱中。在加入样品时，应先将柱内洗脱剂排至稍低于石英砂表面后停止排液，用滴管沿柱内壁把样品一次加完。在加入样品时，应注意滴管尽量向下靠近石英砂表面[2]。样品加完后，打开下旋塞，使**样品进入石英砂层后，再加入少量的洗脱剂将壁上的样品洗脱下来，待这部分**的液面和吸附剂表面相齐时，即可打开安置在柱上装有洗脱剂的滴液漏斗的活塞，加入洗脱剂，进行洗脱。
洗脱剂的流速对柱色谱分离效果具有显著影响。在洗脱过程中，样品在柱内的下移速度不能太快，否则混合物得不到充分分离；如果洗脱剂的流速控制得较慢，则样品在柱中保留的时间长，各组分在固定相和流动相之间能得到充分的吸附或分配作用，从而使混合物，尤其是结构、性质相似的组分得以分离。但样品在柱内的下移速度也不能太慢（甚至过夜），因为吸附剂表面活性较大，时间太长有时可能造成某些成分被破坏，使色谱带扩散，影响分离效果。因此，层析时洗脱速度要适中。若洗脱剂下移速度太慢可适当加压或用水泵减压，以加快洗脱速度，直至所有色带被分开。
如果样品中各组分都有颜色时，可根据不同的色带用锥形瓶分别进行收集，然后分别将洗脱剂蒸除得到纯组分。但大多数有机物质是没有颜色的，只能先分段收集洗脱液，再用薄层色谱或其他方法鉴定各段洗脱液的成分，成分相同者可以合并。
三、仪器与试剂
1． 仪器
玻璃漏斗、玻璃棒、滴管、滴液漏斗、锥形瓶、烧杯、层析柱（20mm×300mm）、旋转蒸发仪。
2。 试剂
95％乙醇、中性氧化铝（100～200目）、荧光黄碱性湖蓝BB乙醇溶液。
四、实验步骤
荧光黄和碱性湖蓝BB均为染料，由于它们的结构不同、极性不同，吸附剂对它们的吸附能力不同，洗脱剂对它们的解吸速度也不同。极性小、吸附能力弱、解吸速度快的碱性湖蓝BB先被洗脱下来，而极性大、吸附能力强、解吸速度慢的荧光黄后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。
1． 装柱
将层析柱（20mm×300mm）洗净干燥后垂直固定在铁架台上，取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底，用长玻璃棒将脱脂棉轻轻塞紧，在脱脂棉上覆盖一层厚0。5cm的石英砂，色谱柱下端置一锥形瓶。关闭柱下部活塞，向柱内倒入95％乙醇至柱高的34处，打开活塞，控制乙醇流出速度为每秒钟1～2滴。然后将用乙醇溶剂调成糊状的一定量的吸附剂中性氧化铝（100～200目）通过一只干燥的粗柄短颈漏斗从柱顶加入，使溶剂慢慢流入锥形瓶。填充吸附剂的过程中要敲打柱身，使装入的氧化铝紧密均匀，顶层水平。当装柱至8 cm时，再在上面加一层0。5cm厚的石英砂。操作时一直保持上述流速，但要注意不能使砂子顶层露出液面，不能使柱顶变干。
2． 加样
把１mg荧光黄和１mg碱性湖蓝BB溶于１mL 95％乙醇中。打开色谱柱的活塞，将其顶部多余的溶剂放出。当液面降至离石英砂顶层时，关闭活塞，将上述溶液用滴管小心地加入柱内。打开活塞，待液面降至石英砂层时，用滴管取少量95％乙醇洗涤色谱柱内壁上沾有的样品溶液。
3． 洗脱与分离
样品加完并混溶后，开启活塞，当液面下降至石英砂顶层相平时，便可沿管壁慢慢加入95％乙醇进行洗脱，流速控制在每秒钟1～2滴，这时碱性湖蓝BB谱带和荧光黄谱带分离。碱性湖蓝BB因极性较小，首先向柱下部移动，极性较大的荧光黄留在柱的上端。通过柱顶的滴液漏斗，继续加入足够量的95％的乙醇，使碱性湖蓝BB的色带全部从柱子里洗下来。待洗出液呈无色时，更换一只接收器，改用水为洗脱剂，这时荧光黄向柱子下部移动，用容器收集，同样至洗出液呈无色为止，这样分别得到两种染料的溶液。用旋转蒸发仪浓缩洗脱液得到染料荧光黄与碱性湖蓝BB。【注释】
[2] 向柱中加样和添加洗脱剂时，应沿柱壁缓缓加入，以免将表层吸附剂和样品冲溅泛起，造成非水平谱带。洗脱剂应连续平稳地加入，不能中断，不能使柱顶变干。因为湿润的柱子变干后，吸附剂可能与柱壁脱开形成裂沟，结果显色不匀，也产生不规则的谱带。
五、思考题
（1） 色谱柱的底部和上部装石英砂的目的何在?
（2） 装柱不均匀或者有气泡、裂缝，对分离效果有何影响?如何避免?
（3） 为什么洗脱的速度不能太快，也不宜太慢?
（4） 为什么荧光黄比碱性湖蓝BB在色谱柱上吸附得更加牢固?王爽第三章有机化合物的制备实验第三章有机化合物的制备实验